|
| In Dec., 2002, I found the very intersting article as follows in magazine, The nature and natural orchids in Japan that was published by Shinkikaku Publishing Com. Inc. The true title was ' Kakiran seedling has arrived at PLM ' but I was modified the title as follows and summarized modified in the scientific report style because you will be able to recognize easier. |
| Artificial germination of Kakiran, Japanese Orchids with symbiotic bacteria isolated from 10 kinds of Japanese Orchids. |
|
Murayama Agricultural High School, Yamagata-Ken, Nobutoshi Saito ( Schoolteacher ) and Masami Misawa ( Technical Schoolteacher ) Shotaro Mizushima et al ( 8 members of Dept. of Biological Technology ) |
 |
|
＜Summery＞ We say, it is very difficult to germinate seeds of Kakiran, Japanese orchid artificially. We succeed the seeds to germinate artificially with symbiotic bacteria and they arrived at PLB in flask. 10 kinds of different Japanese orchids were supplied their symbiotic bacteria isolated by ourselves and were tried to symbiosis with Kakiran's seeds. The two bacteria isolated from Atsumorisou and Miyamauzura were useful to grow the seeds. And we found the cultural medium for growing seeds especially including Benomyl compound. |
|
＜Purpose＞ We know Asumorisouu, Kakiran Kumagaisou etc as the species whose seeds don't germinate artificially. Especially Kakiran's seeds is very difficult to germinate in flasks, we know. In 1922, Nadoson argued in sterile germination against Bargeff in germination with symbiotic bacteria. After we accepted the former, germination with sybiotic bacteria was forgotten. But in this experiments, Kakiran's seed were succeeded to germinate with sybiotic bacteria. We report the results. We investigated the suitable symbiotic bacteria that we isolated by ourselves from 10 kinds of native Japanese orchids. |
|
＜Materials＞ カSeeds of Kakiran：The seeds were harvested from the seed pod in 40 ~ 50 days after hybridization of Kakiran which we cultivated in pot. The seeds were unmatured ones. Usually seeds of Kakiran are matured in 60 ~ 70 days after hybridization. In the days, the seed pod explode to strew seeds. In this case, we harvested the seeds in sterile as much as possible.。 |
 Unmatured seed pod (40〜50days after hybridization ) |
 |
 |
|
Seeds in one seed pod of Kakiran
|
Seeds of Kakiran
|
|
Aynbiotic bacteria isolation medium：pH4〜5 ( C1ementsら1979 ) Seedling medium：Oats agar medium (pH5.2〜5.5) PLB growing medium ：MS Medium (Withought sugar、pH5.8)、Benomyl 40mg/L 10 kinds of Japanese orchid for isolation of symbitic bacteria ：Uchouran, Shunran, Kokuran, Kakiran, Paphiopedilum , Cymbidium, Atsumorisou, Shiran, Miyamauzura and Nejibana. The scientific name of bacteria was not identified.。 ラン菌生育抑制剤としての殺菌剤：テトラサイクリン塩酸塩、ストンプトマイシン硫酸塩、ベノミル剤。 |
|
＜Methods＞ 種子の殺菌：次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)を減菌水で有効塩素濃度を1%に希釈し、種子を5分問、試験管ミキサーで殺菌した。次亜塩素酸ナトリウムによる殺菌は単なる殺菌効果だけではなく、傷つけ処理(胚を無傷の状態で種皮を化学的に傷をつける効果)を行うことを目的とする。 |
 |
 |
次亜塩素酸ナトリウム溶液をピペット(減菌済み)で捨て、減菌水で3分間の洗浄を2回繰り返した。滅菌水を除き、残った種子を播種に用いた。1つのさやからフラスコ5本は播くことができた。 |
|
ラン菌のランの根から分離：ラン菌を採取するランの根を洗い、70%エタノール1秒、塩化水銀（昇汞、使用禁止消毒剤です：田中）1000倍液に10秒浸して減菌水で洗浄した。その後、消毒液を含んだ根の両端を切り捨て、中央部分を1mmの輸切りにして分離用培地に植えつけた。ウチョウランなどの球根の場合には、表皮をむいて同様に行うと分離しやすい。 ラン菌の純化：PDA培地。ジャガイモ200g/Lをサイの目に切り炊て柔らかくし、ショ糖、寒天を加えた。共生菌分離用培地で菌糸が発生したら、他の雑菌に汚染されないように菌糸の一部をかきとって減菌水で希釈し、PDA培地に接種した。場合に応じ、これを繰り返してラン菌を純化した。 |
| カキラン種子の播種とラン菌の接種：洗浄を終えた種子をピンセットで播種用培地に置いた濾紙（3cm角）上に丁寧に植え付けた。分離したラン菌をそれぞれ、ピンセットでひとつまみ(耳掻き程度)を播種した濾紙の一端に接種した。その後、アルミホイルで蓋をして、20℃の暗黒で1か月培養したあと、22〜25℃の照明培養条件に移して培養した。このとき、すでに菌糸が培地表面に放射状もしくは同心円状に広がり、播種した種子に到達していた。菌糸は傷つけ処理をした種子の表面のすき間から入り込み胚に到達していると考えられる。 |
培地上の濾紙の上に播種し、さらに共生菌を接種 （2002年8月7日） |
 |
 |
| アツモリソウの菌をピンセットでひとつまみとって接種する。 | 発芽(PLB形成)前の状態。周囲はアツモリソウから分離した菌。 |
|
＜Results and と考察＞ 播種後60日で、カキランの種子は発芽した。カキランの発芽に有効なラン菌は、アツモリソウから分離した菌(アツモリソウ菌)とミヤマウズラから分離した菌(ミヤマウズラ菌)であった。 カキランとアツモリソウの自生している環境を比較すると、標高差は大きく、両者の接点は認めにくく、これらの関係は不思議としかいいようがない。本校でカキランがラン菌による共生発芽に成功したのは平成13年のことで、このとき、次亜塩素酸ナトリウム溶液による傷つけ処理を行わないで播種していた。また、カキランが培地上で発芽するための熟度はたいへん微妙であることは解っていた。しかし、傷つけ処理を伴う発芽は偶然に見いだされた。学生の一人が交配後40日未満のカキランのさやをとろうとしたとき、さやを落として足で踏んでしまった。そこで、この種子を次亜塩素酸ナトリウムの1%溶液で滅菌し、ラン菌を接種した濾紙の片隅に播種して発芽という結果を得ることになった。 |
 |
|
播種して60日後、春化処理なしでPLB形成
PLB確認:2002年10月9日 |
 |
PLBの顕微鏡写真
|
|
この研究を本校で始めてから5〜6年になる。事前研究は比較的発芽が容易なウチョウランを用いて共生発芽を試みた。ウチョウランの発芽に有効だったラン菌は、シュンラン菌とコクラン菌であった。これらのウチョウランはその後も培地培養され鉢上げを行い、今年(2002年)開花した。播種に用いた種子は完熟に近い90日程度の種子で、傷つけ処理も春化処理もせずに最短30日でプロラメラボディー(PLB)を形成した。鉢上げまでの過程で最も困難なのは、PLBを培養し続ける培地の組成である。培地にショ糖を加えるとラン菌が繁茂しすぎてウチョウランを堤没させてしまった。ウチョウランとラン菌の共生バランスを成立させるという問題を解決するために数年を要した。その培地の最大の課題はラン菌をいかにコントロールするかであった。ラン菌の抑制試験をはじめ、ラン菌の繁殖を抑制することに重点を置いた。抑制は第一に無糖、第二に殺菌剤を加えることで効果が上がった。除菌培地としても使用されているテトラサイクリン塩酸塩、ストンプトマイシン硫酸塩、ベノミル剤などを検討したところし、ベノミル剤が最も効果的であった。ラン菌を生かさず殺さずの濃度を検討し、40mg/リットルで培地に添加することが決定した。糖がないフラスコの中でランの胚を培養しながらラン菌と共生させることが重要な課題である。基本培地はハイポネックスやLS,MSなどについて検討したところ、比較的安定にラン菌をコントロールできたのは、MS培地であった。このようにしてPLB育成培地が完成した(材料参照)。その後、鉢上げしたウチョウランは、ラン菌による順化をすでに終えていることもあって、とても丈夫で強健に育った。 上述したウチョウランの基礎研究がそのままカキランに応用するとは思えないが、ひとつのラン菌を利用した培養の指針になるものとしてとらえている。今後、カキランをどのように継体培養していくかが課題である。 |
|